شناسایی و تعیین گونه عامل  لیشمانیوز پوستی با استفاده   از روش PCR اختصاصی در بیماران مراجعه کننده به   مرکز بهداشت شهرستان گنبد کاووس از استان گلستان 

 

          پژوهشی 

 

 

مجـلـــــه دانشــــگاه عــلـــــوم پزشــکـــــی مــازنــــــدران  دوره بیست و یکم   ویژه نامه 1   اسفند  سال 1390   (92-85)

 

شناسایی و تعیین گونه عامل  لیشمانیوز پوستی با استفاده   از روش PCR اختصاصی در بیماران مراجعه کننده به

مرکز بهداشت شهرستان گنبد کاووس از استان گلستان

 

عبدالستار پقه1           مهدی فخار2          

فاطمه مسگریان3           شیرزاد غلامی2          فرهاد بدیعی 3 

 

چکیده

سابقه و هدف : استان گلستان یکی از کانون های آندمیک لیشمانیوز پوستی محسوب می شـود . هـدف از ایـن مطالعـهارزیابی روشPCR  (واکنش زنجیـره ای پلیمـراز) اختـصاصی  بـر روی اسـلایدهای رنـگ آمیـزی شـده بیمـاران بـه منظـورتشخیص بیماری  و  شناسایی گونه های مختلف انگل لیشمانیا در بیماران مراجعه کننده به آزمایشگاه مرکز بهداشت شهرستان گنبد کاووس بود.

مواد و روش ها : این مطالعه مقطعی در سال 1389  صورت گرفت. تشخیص بیماری با تهیه اسمیر مستقیم از ضـایعات  پوستی و رنگ آمیـزی گیمـسا بـود و در صـورت منفـی شـدن آن،  از روش PCR اختـصاصی بـر روی  DNA کینتوپلاسـت  (kDNA) استخراج شده از اسمیرهای مستقیم  به منظور  تعیین جنس و گونه انگل لیـشم انیا اسـتفاده شـد. اطلاعـات بـه دسـتآمده ثبت و توسط نرم افزار SPSS مورد تجزیه و تحلیل آماری قرار گرفت.

یافته ها : در این مطالعه303 بیمار مشکوک به لیشمانیوز پوستی مورد بررسی قرار گرفتند که نتیجـه آزمـایش مـستقیم238 نفر  (5/78 درصد ) مثبت شد . همچنین  با ا نجام روش PCR، بر روی 65 گسترش مستقیم فاقـد جـسم لیـشمن، در تعـداد

34 مورد  (3/52 درصد )، DNA کینتوپلاست انگللیشمانیا شناسایی شد . همچنین با استفاده از پرا یمرهای اختصاصی گونـه،انگل لیشمانیا در تمامی بیماران لیشمانیا ماژور بود.

استنتاج : از آن جایی که در بسیاری از موارد اسمیر مستقیم، منفی گـزارش مـی شـود  و ایـن روش از حـساسیت پـایینیبرخوردار است و از سوی دیگرPCR  دارای حساسیت بالایی است، لذا پیـشنهاد          مـیشـود  در صـورت مـشکوک بـودن بـه بیماری به ویژه در مناطق آندمیک، به منظور تشخیص دقیق تر و یا رد آن، لزوماً از روش PCR استفاده گردد.

 

واژه های کلیدی: لیشمانیوز پوستی، PCR اختصاصی،  kDNA، لیشمانیا ماژور

 

مقدمه

 

بیماری لیشمانیوز توسـط گونـه هـای مختلـف تـک

 

طرح تحقیقاتی 24-89 دانشگاه علوم پزشکی مازندران

مولف مسئول: مهدی فخار- ساری: کیلومتر 18 جاده خزر آباد، مجتمع دانشگاهی پیامبر اعظم، دانشکده پزشکی     E-mail: mahdif53@yahoo.com  1. گروه انگل شناسی و قارچ شناسی، کمیته تحقیقات دانشجویی، دانشکده پزشکی، دانشگاه علوم پزشکی مازندران

2. گروه انگل شناسی و قارچ شناسی، مرکز تحقیقات بیولوژی سلولی و مولکولی، دانشکده پزشکی، دانشگاه علوم پزشکی مازندران

3. دانشگاه علوم پزشکی گلستان

) تاریخ دریافت : 18/4/90          تاریخ ارجاع جهت اصلاحات : 29/9/90           تاریخ تصویب : 27/10/90

 

یاختــه ای از جــنس لیــشمانیا ایجــاد مـ ـیشــود. ناقــل آن

پـشه هـای خـاکی مـاده از جـنس فلبوتومـوس اسـت(1).

بیماری لیشمانیوز پوستی در 82 کشـور جهـان آندمیـک  اســت و حــدود 90 درصــد مــوارد آن از کــشورهایافغانـستان، پاکـستان، عربـستان، ترکیـه، ایـران، سـوریه،الجزایر، برزیل و پرو گزارش مـی شـود . در حـال حاضـر12 میلیون نفر در دنیا از این بیماری رنج می برنـد . میـزانبروز سالیانه بیمـاری در دنیـا 5/1-1 میلیـون تخمـین زدهمی شود(2) میزان بروز  بیماری در  ایـران 28 مـورد در هـر هزار نفر جمعیت تخمین زده           میشود که بیشترین مـواردآن از  استان های اصفهان و شـیراز بـا 66/1 مـورد در هـرهزار نفر جمعیـت و کمتـرین مـوارد از اسـتان مازنـدران22/0 مرد در هر هزار نفرجمعیت گـزارش شـده اسـت واین میزان بروز در ایران در سال 1386، 37 درصـد هـزاربــوده اســت (3). بیمــاری ســالک در بــیش از نیمــی ازاستان هـای کـشور بـه صـورت بـومی وجـود دارد کـه دریازده استان شامل گلستان، اصفهان، سمنان، یزد، کرمان،  فارس، بوشهر، هرمزگان، خوزسـتان ،ایـلام و سیـستان وبلوچستان شیوع بالایی دارد(3). در ایران سالانه حدود 20 هزار نفربه سالک مبتلا می شوند که بـر اسـاس تحقیقـاتبه عمل آمده میزان واقعی آن چهار تـا پـنج برابـر میزانـیاست که گزارش شده است(3). شهرستان گنبد کـاووساز جمله کانون های قدیمی بیمـاری در ایـران اسـت. کـهبه طور میانگین سالانه 160 مورد لیشمانیوز جلدی از ایـن شهرستان گزارش شده است(4).

به طورمعمول تشخیص لیشمانیوز جلـدی بـر اسـاسعلای م کلینیکـی یافـت شـده در بیمـاران و تأییـد آن از طریق  روشهای پارازیتولوژی از جمله آزمایش مـستقیمویا کشت  میباشد که این  روشها ب ه عنوان معیار طلایـیمطرح هستند . اگر چه روش مشاهده مستقیم اسمیر زخـمبـا میکروسـکوپ سـ ادهتـرین روش در شناسـایی انگـل لیشمانیا مـی باشـد امـا حـساسیت پـایین آن در تـشخیصمـوارد دارای تعـداد کـم انگـل(میـزان کـم پـارازیتمی) نشان دهنده ضعف این روش  مـیباشـد (7- 5). روش هـایکشت معمول نیـز از حـساسیت و ویژگـی نـسبتاً مناسـبیبرخوردار هستند امـا ایـن روش هـا نیـز  محـدودیتهـایخاص خـود را دارنـد. از جملـه ایـن مـوارد مـی تـوان بـهطولانی بودن زمـان انکوباسـیون، کـاهش معنـی داری در تشخیص  پروماستیگوتها در زخم های مـزمن نـسبت بـهزخـم هـای حـاد(6،8)، نیـاز بـه تعـداد زیـاد آماسـتیگوت آسپیره شده از زخم اشاره کرد. از سوی دیگر شناسـایی گونه لیشمانیا، به دلیل تفاوت گونه ها از نظرمیزان حـدتو نحوه پاسخ به رژیم های درمانی مختلف مهم است چراکه تشخیص صحیح گونه جهت پیشگویی هـای بـالینی وتجـویز رژیـم درمـانی مناسـب و اختـصاصی، ضـروریمی باشد(5،6).

امروزه جهت شناسایی گونـه هـای انگـل لیـشمانیا ازروش های مولکولی مانند انواعPCR  استفاده می شود. از جمله مزایای روش مولکولی می توان به مواردی از جملهنیاز به مقدارکمDNA ، عدم ت أثیر شرایط                 مخدوشکننده محیط و میزبان و قابلیت بررسی تعـداد زیـادی نمونـه دریک زمان کوتاه و حساسیت بالای تست اشاره نمود(9،10). بـه طـور کلـی درمـان مـوثر بـستگی بـه شـناخت گونـه لیشمانیای عامل بیمـاری دارد. از سـوی دیگـر بـر اسـاسپروتکــل کــشوری درمــان ســالک و همچنــین ســازمانبهداشت جهانی ، تمام موارد ابتلا به سالک نوع روسـتاییبا عامل لیشمانیا ماژور در صورت وجـود زخـم در نقـاطپوشیده بدن  نیاز بـه درمـان ندارنـد(3، 7- 5). زیـرا باعـثمصونیت شخص خواهد شد. با توجه به تابلو بالینی بسیارگــسترده و پیچیــده ضــایعات پوســتی بیمــاری و مــوارد تـشخیص افتراقـی متعـدد و از سـوی دیگـر چـون روش مستقیم تشخیص بیماری، از حـساسیت کـافی برخـوردارنیست و همچنین متفاوت بودن پروتکل درمانی در افـرادمبتلا به سالک نوع شهری و روستایی لذا مطالعه حاضر با هـدف، شـناخت بیـشتر وضـعیت دموگرافیـک بیمـاری، شناسایی مولکولی گونه هـای مختلـف و ارزیـابی روشمولکـولی PCR (واکـنش زنجیـ رهای پلیمـراز) بـر روی اسـلایدهای رنـگ آمیـزی شـده جهـت تـشخیص دقیـق بیماری در افراد مراجعه کننده به مرکز بهداشت شهرستان گنبد کاووس طراحی شد. ضمناً در این خصوص تـاکنونمطالعه ای در استان گلستان انجام نشده است.

 

مواد و روش ها

ایــن مطالعــه مقطعــی در ســال 1389روی بیمــاران مراجعه کننده به مرکز بهداشت شهرستان گنبـد کـاووس (واقع در بخش شرقی استان گلستان) انجام شـد (تـصویرشــماره 1). بیمــارانی کــه لیــشمانیوز پوســتی در               آنهــا تشخیص داده شـد، مـورد بررسـی اپیـدمیولوژی (توزیـعسنی، جنسی، زمانی و مکانی، محل زخم و تعداد زخـم) قرار گرفتند . تشخیص بیماری بـا تهیـه اسـمیر مـستقیم ازضـایعات و رنـگ آمیـزی بـه روش گیمـسا بـود. در ایـن روش برش کوچکی در اطراف زخـم ایجـاد کـرده و ازسروزیته این ناحیه گسترش نازکی روی لام میکروسکوپی تهیه شد. لام های تهیه شده به روش گیمسا رنگ آمیـزیشــــده و در زیــــر میکروســــکوپ اجــــسام لیــــشمن (آماســتیگوت هــا) در داخــل و یــا خــارج ماکروفاژهــا جستجو شدند. در صورت منفی شـدن روش مـستقیم، از روش PCR اختصاصی  جهـت شناسـایی  جـنسلیـشمانیا  استفاده شد.

برای استخراج  DNA از اسلایدهای رنـگ آمیـــزیشـده مربـوط بـه بیمـاران مبـتلا بـــــه لیـشمانیوز پوسـتی اسـتفاده شـد. بـرای ایـن منظـور از روش High salt بـا تغییــرات جزیــی اســتفاده گردیــد(11). ســپس DNA اســتخراج شــده، جهــت آزمــایش واکــنش زنجیـ    ـرهای پلــــــی  م ــراز اختصاصی  جنس و گونـه مـورد اسـتفادهقـرار گرفـت. در روش PCR بـا اسـتفاده از پرایمرهـای عمـــومی (جهـــت تـــشخیص جـــنسلیـــشمانیا) RV1

(5`-CTT TTC TGG TCC CGC GGG TAG G-3`)  (RV2 (5`-CCA CCT GGC CTA TTT TAC ACC A-3 قطعــه ثابــت  (145جفــت بــاز ) از حلقـ ـههــای کوچــکDNA(minicircles) کینتوپلاست انگل لیشمانیا تکثیر ودر یک مرحله روشPCR  انجام شد(12). همچنـین جهـت تعیین گونـه انگـل بـا اسـتفاده از پرایمرهـای اختـصاصی

(5- GGG GTT GGT GTA AAA TAG GG-3)

5- TTT GAA CGG GAT TTC TG-3) LIN LIN17) قطعه متغیر از حلقه هـای کوچـکDNA (minicircles)  کینتوپلاست انگل لیشمانیا تکثیر و در یک مرحلـه روشPCR اختصاصی، با انجام تغییراتی در تعداد                 سـیکلهـا ومواد به کار رفته اصلاح آن بر اساس نمونـه هـای بـالینی،انجام شد (13). پس از انجامPCR ، محـصول بـر روی ژلآگاروز 5/1 درصد الکتروفورز شده با اتیـدیوم برومایـدرنگ آمیزی گردید. سپس با توجه بـه شـاخص وزنـی ومقایسه باند حاصل از نمونه ها با                 گونـههـای مرجـع انگـللیشمانیا، جنس انگل تعیین گردید. جمـع آوری اطلاعـات به وسیله فرم پرسشنامه انجام و اطلاعات به دست آمـده بـااســتفاده از نــرم افــزارSPSS  و آزمــون کــای دو مــوردتجزیه و تحلیل قرار گرفتند.

 

یافته ها

بررسی اپیدمیولوژیک لیـشمانیوزپوستی در بیمـارانمراجعه کننده به مرکز بهداشت شهرستان گنبد کـاووسنشان داد که از تعداد 303 بیمار مشکوک به این بیماری،گسترش مستقیم 238 نفـر (5/78 درصـد ) از نظـر وجـودجسم لیشمن در زخم، مثبت بودند که از این تعداد، 147 نفر (5/48 درصد) مؤنث و 156 نفر (5/51 درصد) مذکر

بودنـد، از نظـر آمـاری اخـتلاف معنـی داری بـین جـنس مؤنث و مذکر مشاهده نشد. همچنین در گسترش مستقیم

65 نفر (5/24 درصد) جسم لیشمن مشاهده نشد.

از نظرتعــداد ضــایعه نیــز 6/34 درصــد مــوارد تنهــادارای یک ضـایعه، 7/21 درصـد دارای 2 ضـایعه، 6/12 درصـد سـه ضـایعه و 1/31 درصـد بیـشتر از سـه ضـایعه داشتند. عضو با بیشترین میـزان ابـتلا درایـن  بیمـاران، دررتبه نخست،  دست  با  9/36 درصد و بعد از آن به ترتیـبپا 6/30 درصد ، اعضای صـورت 2/20 درصـد بودکـه  از نظر آماری اختلاف                 معنیداری بین ابتلا اعـضاء مختلـف  مشاهده نشد . در 3/12 درصد مـوارد، زخـم نیـز بـر رویسایر نقاط بدن مشاهده شد. فراوانـی بیمـاری مـذکور درگروههای مختلف سـنی بـه ترتیـب در نمـودار شـماره 1آمده است که بیشترین فراوانی در گروه سنی زیر 5 سال(3/30 درصد ) و کمترین آن در گروه سنی 35-30 سال

(9/2 درصد ) بود. روند زمانی بیماری بر اساس مـاه هـایسال در استان گلستان نشان می دهد که بطور معنی داری مـوارد بیمـاری در فـصل پـائیز افـزایش یافتـه و بیـشترین موارد مربوط به ماه آبان با 7/31 درصد وکمترین مـواردمربوط به ماه اردیبهشت (4/0 درصـد) بـود  (034/0p=).

از نظر محل سکونت نیز 2/11 درصد بیماران ساکن شهرگنبد کاووس  و  8/88 درصد ساکنان روسـتاهای حومـه، سربازان و کارگران در نوار مرزی بودند.همچنین در اینمطالعه بر روی 65 نفر از بیماران مراجعه کننده که روشمــستقیم آن هــا منفــی بــود، از روش PCR (واکــنش زنجیره ای پلیمـراز) بـا اسـتفاده از پرایمرهـای عمـومی واختصاصی به ترتیب جهت شناسایی جنس و گونه انگـل

لیــشمانیا انجــام گرفــت کــه در تعــداد 34 مــورد (3/52 درصــد) از آن هــا DNA کینتوپلاســت انگــل لیــشمانیا شناسایی شد  (تصویر شماره 1). همچنین گونـه  انگـل  درمقایـسه بـا گونـه هـای مرجـع در تمـام نمونـه هـای مـورد بررسی لیشمانیا ماژور بود (تصویر شماره 2).

 

  

تصویر شماره 1: نتیجه الکتروفورز محصولاتPCR اختصاصی نمونه های اسمیر مستقیم با پرایمرهای RV1 و RV2 در ژل آگاروز 5/1 درصد  M= مارکر bp 100

(145 bp) (MRHO/IR/75/ER) استاندارد L.m =C+  کنترل منفی =C-

شماره های 5-1= نمونه های اسمیر مستقیم بیماران

 

تـصویر شـماره 2: نتیجـه الکتروفـورز محـصولات PCR اختـصاصی نمونـه هـای اسـمیر مـستقیم بـا پرایمرهـای LINR4 و LIN17 در ژل آگاروز 5/1 درصد

  • مارکرi -4 100 bp استاندارد       
  • t استاندارد 5- کنترل منفی
  • m استاندارد شماره های 8-6= نمونه های بیماران

 

35    30.3

30

25

                           13.9                                                 20      درصد فراواني

15

11.9              10.9                                                   10

10                            6.7                           8.5                4.9

5                                                                        2.9

0

04>                                      40‐35 35‐30 30‐25 25‐20 20‐15 15‐10 10‐5      5<سن

 

نمــودار شــماره1 : فراوانــی لیــشمانیوز پوســتی بــر حــسب ســن در شهرستان گنبد کاووس از استان گلستان، 1389

 

بحث

مطالعـه حاضـر بـا هـدف شـناخت بیـشتر وضـعیتدموگرافیــک بیمــاری، شناســایی مولکــولی گونـ ـههــای مختلـــف و ارزیـــابی روش مولکـــولیPCR  (واکـــنش زنجیره ای پلیمراز ) بر رو ی اسلایدهای رنگ آمیزی شـدهجهت تشخیص دقیق بیماری در افـراد مراجعـه کننـده بـهمرکز بهداشت شهرستان گنبد کاووس طراحـی شـد. در این مطالعـه جنبـه هـای مختلـف دموگرافیـک، تـشخیصمولکولی و         یافتههای بالینی  لیشمانیوز پوستی مـورد بررسـی قرار گرفت . شهرستان گنبد کاووس از جمله کانون هـایقدیمی بیماری در ایران است و اغلب مـوارد بیمـاری دراین شهرستان به علت رفت و آمد مردم به روستاهای هـممرز با کشور ترکمنستان صورت مـی پـذیرد (14). بـه علـتموقعیت جغرافیـایی ایـن روسـتاها و هـم جـواری منـاطقمسکونی با لانه های جوندگان و نیز نوع مصالحی کـه درساخت خان ه ها، طویله ها و غیره بـه کـار بـرده شـده، ایـنناحیه محل مناسبی برای تکثیر پشه خـاکی مـی باشـد . بـراساس آمار ثبت شده در مرکز بهداشت شهرسـتان گنبـدکاووس، سـال 1383 تعـداد بیمـاران مبـتلا بـه لیـشمانیوزپوستی 172 نفر بودند که 27 نفر  (7/15 درصد ) از آن هـاساکن شـهر و 145 مـورد (3/84 درصـد ) سـاکن منـاطقروستایی بودند (4). دربررسی ما، 238نفـر (5/78 درصـد )

از مراجعه  کننـدگان بـه مرکـز بهداشـت شهرسـتان گنبـدکاووس به لیشمانیوز پوستی مبتلا بودند کهx  نفـر (2/11 درصد) ساکن شهر وx  نفر (8/88 درصد ) ساکنان روستابودند. این در حالی است که در سال 1383، تعداد مواردبیماری 172 نفـر گـزارش شـده اسـت و سـالیانه بـه طـورمیانگین 160 مورد از بیماری از ایـن شهرسـتان گـزارشمی شود(4). این مطلب حاکی از روند رو به رشد بیمـاریدر استان به ویژه شهرستان گنبد بوده که البته ایـن مطلـبمی تواند مربوط به حساسیت بالای روشPCR  انجـام شـدهدر شناسایی بیماران نیز باشد زیرا در روش مستقیم بـسیاری از بیماران تشخیص داده نمی شوند و این روش حساسیتکمی دارد و بسیاری از بیماران تشخیص داده نمی شوند.

نتایج این مطالعه ، نشان می دهد بیشترین گروه سـنیمبتلا به بیماری در گروه سنی زیر 5 سال بوده است. کـهاین مطلب با مطالعات قبلـی انجـام شـده در یـک کـانونآندمیک جدید در اطراف شهر شـیراز و اصـفهان(15،16) و مطالعـه مـسگریان و همکـاران(14) در اسـتان گلـستان مطابقت دارد . در بررسی مسگریان و همکـاران بیـشترینموارد ابتلا در گـروه سـنی 10-0 گـزارش شـده اسـت ومواردی از ابتلا در سنین بـالای پنجـاه سـال دیـده نـشدهاست. اگر چه الگوی سنی ابتلا به سالک در کـانون هـایمختلف کشور بر اساس میزان آندمیـسیته بیمـاری، گونـهانگل و الگوی ژنتیکی میزبان متفاوت است، امـا بـه طـورکلی افزایش میزان بروز بیماری در سنین پایین حاکی ازبــالا بــودن میــزان آندمیــسیته بیمــاری در یــک منطقــهمی باشد(18-15). فخـار و همکـاران در بررسـی خـود بـرروی بیماران مبتلا به سـالک در شـیراز بیـان کردنـد کـهبیماری مذکور در گروه سنی 25-20 سال     شایعتر بـوده، موارد بیماری در فصل پاییز به طور معناداری افزایش یافتـه است بیشترین موارد بیماری مربوط به ماه آبان می باشد وبین دو جنس اختلاف آماری وجود ندارد(19). همچنـیندر بررسی ما، روند زمانی بیماری بر اساس ماه های سال ، نشان داد که به طور معنـی داری مـوارد بیمـاری در فـصلپاییز افزایش یافته، بیشترین موارد مربوط بـه آبـان مـاه  بـا7/31 درصد وکمترین موارد مربـوط بـه اردیبهـشت مـاه

(4/0 درصد ) بود. در مطالعـه مـسگریان و همکـاران(14) نیز در استان گلستان بـین فـصل مراجعـه و تعـداد مـواردبیماری ارتبـاط معنـی داری گـزارش شـده اسـت کـه بـراساس آن فصل پاییز بیشترین تعداد و فصل بهار کمترینموارد ابتلا را به خود اختصاص داده است. ضمنا نتایج مابا مطالع ات قبلی انجام شده در سایر کانون های آنـدمیکایران از جمله کانون های مهم شیراز، اصفهان و اردسـتانمطابقت دارد (19-15). نتایج بررسی ما نشان مـی دهـد کـهاختلاف     معنیداری بین ابتلا جنس مذکر و مؤنث وجـ ود ندارد که این مطلب بـا سـایر مطالعـات انجـام گرفتـه در اغلـب نقـاط ایـران و همچنـین اسـتان گلـستان مطابقـت دارد(19-14). در مطالعه حاضر دست، عضوی با بیـشترینضایعه( 9/36 درصد ) می باشد و به دنبال آن صـورت، پـاو سایر نقاط بدن قرار دارند. به طورکلی ضایعات پوسـتیسالک معمولاً  در نقاط باز بـدن و جاهـایی کـه بیـشتر درمعرض گزش پشه خاکی است به وجود مـی آینـد . در نـوعشهری ضایعات غالبـاً روی صـورت و در نـوع روسـتاییبیشتر روی دست و پا ظاهر می شوند(1، 19-14).

با توجه به نتایج بررسی حاضر و همچنـین مطالعـاتقبلی، منطقه گنبد کاووس یکی از  کـانونهـای انـدمیکبیماری لیشمانیوز نوع روستایی به شمار مـی رود. در ایـنمنطقه، اغلب موارد زخم حاد در          گروههای سنی زیـر دهسـال و سـاکن منـاطق روسـتایی هـم مـرز بـا جمهـوری ترکمنـستان بـویژه بخـش داشـلی بـرون شهرسـتان گنبـد(تصویر شماره 1) مشاهده می شوند؛ اما به دلیل مصونیتنسبی، ابتلا به اشکال حـاد بیمـاری در بزرگـسالان کمتـرمشاهده می شود و در عوض جای زخـم (اسـکار ) بیـشتردر این سنین مشاهده                 میگردد. شواهد اپیـدمیولوژیک ومولکولی در استان گلـستان نـشان مـی دهـد گونـه غالـبانگل،  لیشمانیا ماژور است.

مسگریان و همکاران در سال 1385 با بررسی میزانشـیوع لیـشمانیوز جلـدی، کـشت و تعیـین هویـت انگـللیشمانیا جـدا شـده از بیمـاران مبـتلا بـه سـالک بـا روشPCR در روســتاهای مــرزی شهرســتان گنبــد کــاووسگزارش کردند که میـزان شـیوع زخـم حـاد 5/0 درصـداست و ارتباط معنی دار بین دو جنس از نظر ابـتلا وجـودندارد(14). در این مطالعه که بطور تصادفی در 5 روستا وبه صورت خانه به خانه انجام شده اسـت بـا کـشت انگـللیشمانیا تنها 46 ایزوله بدست آمده است و سـپس انجـامITS-PCR بر روی ایزوله های ب ه دست آمده، گونه انگـللیشمانیا ماژور تعیین شـده اسـت. امـا در مطالعـه حاضـر،کارآیی روشPCR  در شناسایی انگل لیشمانیا و مقایـسهآن با روش اسمیر مستقیم و همچنین تعیین هویـت گونـهانگل ب ه طور مـستقیم بـر روی نمونـه هـای بـالینی بیمـاران(اسمیرهای مستقیم ) بدون استفاده از روش وقـت گیـر و پـرهزینه کشت انجام پذیرفته است. علاوه بر آن مطالعه حاضر در سال89 (5 سال پس ازآخرین مطالعه) انجام شده است.

روش های تشخیص  لیشمانیوز پوستی عمـدتاً مبتنـیبــر روش هــای انگــل شناســی و مــشاهده مــستقیم انگــلمــی باشــد. در مــورد ســالک نــوع شــهری و روســتایی روش هـای سـرولوژی کـارایی چنـدانی ندارنــد (1،7-6).

تشخیص این بیماری هر چند با فراهم نمودن گسترش اززخم بیمار و        رنگآمیزی گیمسا بـه راحتـی امکـان  پـذیر است، اما در مواردی که زخم مزمن بوده و شـمار انگـل اندک باشد،  تشخیص را مشکل می کند(9،20،21). عـلاوهبـر آن در تـشخیص مـستقیم، امکـان تعیـین گونـه انگـل وجود ندارد و برای تشخیص گونه، کشت انگل و تولیـدانبوه آن برای تزریق به حیوان آزمایشگاهی یا اسـتفاده ازروش ایزوآنــزیم و PCR مــورد نیــاز اســت. روش هــای متکــی بــر DNA در تــشخیص بیمــاری لیــشمانیوز و شناسایی گونه هـای آن در سـال هـای اخیـر رواج فـراوانیافته است (9،10،22-19). مطالعات مختلف نشان مـی دهـدکه، روش هایPCR  مبتنی برDNA  کینتوپلاسـت انگـللیشمانیا روش حساسی در تشخیص بیمـاری بـه ویـژه درمـوارد مـزمن اسـت(19،21،22). در مـورد کـارآیی روش PCR در مطالعه حاضر مشخص شـد در 3/52 درصـد ازمواردی که نتیجه آزمایش مـستقیم منفـی بـوده اسـت بـاروشPCR  مثبت شـده اسـت. لـذا بـه منظـور تـشخیصدقیق تر بیماری و جلوگیری از تشخیص اشـتباهی (منفـیکاذب) بهتر است از روشPCR  استفاده شود. نتایج اینمطالعه با سـایر مطالعـات انجـام گرفتـه سـایر محققـین ومطالعــات قبلــی مــؤلفین ایــن مقالــه هــم خــوانی دارد (9،10،19،21،22). فخــار و همکــاران در بیمــاران مراجعــهکننده به آزمایشگاه گروه انگل شناسی دانشکده پزشکیشیراز با استفاده از واکـنش زنجیـره ای پلیمـراز، بـر رویتعداد 62 گـسترش مـستقیم کـه جـسم لیـشمن در            آنهـایافـت نـشده بـود، در 35 مـورد (4/56 درصـد) از آن هـا DNA انگل را شناسایی نمودند(19).

کرمیان و همکاران در انجام روشPCR  ختصاصی

جــنس بــا اســتفاده از پرایمرهــای13A  و 13B بــر روی اسلاید رنگ آمیزی شده بیماران مبتلا به سالک، ایـن روش را در شناسایی موارد غیر تیپیک و مزمن بسیار کارآمدتراز روش مـستقیم اعـلام نمودنـد. ضـمناً در ایـن مطالعـه، ویژگیPCR  اختصاصی گونه بـا اسـتفاده از پرایمرهـایLINR4 وLIN17  در شناسایی گونه انگـل در مـوارد غیـرتیپیک بیماری 100 درصد گزارش شده است(21).

پرایمرهـــای LINR4 و LIN17 اســتفاده شـــده در مطالعه حاضر، از  روش  Aransay و همکاران(13) اقتباسشده است که البته این محقق روش Semi-nested PCR را کــه یــک روش  PCR دو مرحلــه ای اســت معرفــیکرده اند؛ اما در این مطالعـه، بـه منظـور برطـرف نمـودناشکالاتی کـه در             روشهـایPCR  دو مرحلـه ای وجـوددارد، از قبیل وقت گیر بودن، دشواری در اجـرا بـ ه ویـژهدر بررسی های اپیدمیولوژیک و نیز تشخیص بیمـاری بـااســـتفاده از نمونـــه هـــای بـــالینی و دارا بـــودن عوامـــلمخدوش کننده بیشتر (از جمله آلـودگی متقـاطع)، روشPCR یک مرحله ای طراحی شـده و مـورد بررسـی قـرارگرفت که علاوه بر قابلیت تعیین گونه انگل و مقرون بـهصـرفه بـودن، از سـهولت نـسبی و حـساسیت و ویژگـی مناسبی نیز برخوردار  میباشد. با توجه بـه تـابلوی بـالینیبسیار گسترده ضایعات پوستی و موارد تشخیص افتراقـیمتعدد و از سوی دیگر، چون روش اسمیر مستقیم به عللمختلف، ب ه ویژه در موارد پارازیتمی پـایین، از حـساسیتکافی برخوردار نیست لذا توصیه می شود در                کانونهـایبومی بیماری در صـورت مـشکوک بـودن بـه بیمـاری ومنفــی شــدن روش مــستقیم، از روشPCR  اختــصاصی جنس به منظور تشخیص بیماری و علاوه بـر آن ازPCR  اختـصاصی گونـه بـر روی نمونـ ههـای بـالینی تـازه و یـا اسمیرهای مستقیم رنگآمیزی شده، برای شناسایی گونهانگل به منظور به کارگیری روش درمانی مؤثرتر اسـتفادهگردد.

نتــایج مطالعــه حاضــر حــاکی از بــالا بــودن میــزانآندمیــسته (بــومی) بیمــاری ســالک روســتایی بــا عامــللیشمانیا ماژور در شهرستان گنبد  میباشد. همچنـین ایـننتایج ضرورت انجام روش PCR به طور مستقیم بـر روینمونه های بالینی بیماران از جملـه اسـمیر مـستقیم را چـه درموارد منفی شدن و چه در موارد تعیین گونه تأیید  میکند.

 

سپا سگزاری

بدینوسیله از کلیه ی همکاران مرکز بهداشـت گنبـدو مرکز بهداشت استان گلستان بـه خـاطر همکـاری هـایارزشمندشان قدردانی مـی شـود . ضـمناً از سـرکار خـانممریم پورحاجی باقر به خاطر همکاری صمیمانه و آنـالیزداده ها تشکر و قـدردانی بـه عمـل مـی آیـد . ایـن مطالعـهحاصل بخشی از طرح تحقیقـاتی 24-89 دانـشگاه علـومپزشــکی مازنــدران مــی باشــد. بدینوســیله از معاونــتتحقیقـات و فنـاوری دانـشگاه علـوم پزشـکی مازنـدران به خاطر تأمین هزینه های مالی تشکر می نماییم.

 

 

Education publications. 2009 (Persian).

.4 Provincial Health Center of Golestan, CDC records. 2009 (Persian).

.5 Berman JD. Human leishmaniasis: clinical, diagnostic, and chemotherapeutic developments in the last 10 Years. Clin Infect Dis 1997; 24(4): 684-703.

.6 Murray HW, Berman JD, Davis CR, Saravia NG. Advances in leishmaniasis. Lancet 2005; 366(9496): 1561-1577.

.7 Expert Committee: Control of leishmaniasis. Technical Report Series 793. WHO, Geneva Switzerland, 1990. Avaliable from: http:// whqlibdoc.who.int/trs/WHO_TRS_793.pdf

 

References

.1 Ardehali S, Rezaei HR, Nadim A(eds).

Leishmania     parasite     and       leishmaniosis.

2nd ed. Tehran: Iran University. Pressl; 1994. p 3-11 (Persian).

.2 World Health Organization (WHO). First WHO report on neglected tropical diseases: “working to overcome the global impact of neglected tropical diseases”. Available from: http://www.who.int/ neglected_diseases/ 2010 report/en/ Accessed 12 October 2010.

.3 Shirzadi MR, Sharifian J, Zeinali M, Qarahgozloo F, Pourmozaffari J, Doosti S, editors. Successful in zoonosis control programmes.

1st ed. Tehran: Ministry of Health and Medical  Shiraz, Iran. Trans R Soc Trop Med Hyg 2009; 103(7): 727-730.

.61 Yaghoobi-Ershadi MR, Javadian E. Zoonotic cutaneous leishmaniasis to the north of Isfahan. Human infection in 1991. Bull Soc Pathol Exot 1995; 88(1): 42-45.

.71 Yaghoobi-Ershadi MR, Jafari R, Hanafi-Bojd AA. A new epidemic focus of zoonotic cutaneous leishmaniasis in central Iran. Ann Saudi Med 2004; 24(22): 98-101.

.81 Yaghoobi-Ershadi MR, Hanafi-Bojd AA, Akhavan AA, Zahrai-Ramazani AR, Mohebali M. Epidemiological study in a new focus of cutaneous leishmanisis due to Leishmania major in Ardestan town, central Iran. Acta Trop 2001; 79(2): 115-121.

.91 Fakhar M, Mikaeili F, Hatam GR, Habibi P, Karamian M, Motazedian MH, et al.

Molecular epidemiology survey of cutaneous leishmaniasis in referral patients to Parasitology lab at Shiraz School of Medicine and importance application of PCR for diagnosis of disease. J Jahrom Univ Med Sci 2010; 8(1): 1-5 (Persian).

.02 Motazedian MH, Karamian M, Noyes HA, Ardehali S. DNA extraction and amplification of Leishmania from archived, Giemsa-stained slides, for the diagnosis of cutaneous leishmaniasis by PCR. Ann Trop Med Parasitol 2002; 96(1): 31-34.

.12 Karamian M, Motazedian MH, Fakhar  M, Pakshir K, Jowkar F, Rezanezhad  H. Atypical presentation of Old-World cutaneous leishmaniasis, diagnosis and species identification by PCR. J Eur Acad Dermatol Venereol 2008; 22(8): 958-962.

.22 Pourmohammadi B, Motazedian MH, Hatam GR, Kalantari M, Habibi P, Sarkari B. Comparison of Three Methods for Diagnosis of Cutaneous Leishmaniasis. Iran J Parasitol 2010; 5(4): 1-8.

.8 Salman SM, Rubeiz NG, Kibbi AG. Cutaneous leishmaniasis: Clinical features and diagnosis.

Clin Dermatol 1999; 17(3): 291-296.

.9 Al-Jawabreh A, Schoenian G, Hamarsheh O, Presber W. Clinical diagnosis of cutaneous leishmaniasis: A comparison study between standardized graded direct microscopy and ITS1-PCR of Giemsa-stained smears. Acta Trop 2006; 99(1): 55-61.

.01 Marques MJ, Volpini AC, Machado-Coelho GL, Machado-Pinto J, da Costa CA, Mayrink W, et al. Comparison of polymerase chain reaction with other laboratory methods for the diagnosis of American cutaneous leishmaniasis: diagnosis of cutaneous leishmaniasis by polymerase chain reaction. Diagn Microbiol Infect Dis 2006; 54(1): 37-43.

.11 Aljanabi SM, Martinez I. Universal and rapid salt-extraction of high quality genomic DNA for PCR-based techniques. Nucleic Acids Res 1997; 25(22): 4692-4693.

.21 Lauchaud L, Marchergni-Hammami S, Chabbert E, Dereure J, Dedet JP, Bastien P. Comparision of six PCR methods using peripheral blood for detection of canine visceral leishmaniasis.

J Clin Microbiol 2002; 40(1): 210-215.

.31 Aransay AM, Scoulica E, Tselentis Y. Detection and identification of Leishmania DNA within naturally infected sand flies semi nested PCR on minicircle kinetoplastic DNA. Appl Environ Microbiol 2002; 66(5): 1933-1938.

.41 Mesgarian F, Nourian R, Mahmoudi Rad M, Hajaran H, Shahbaz F, Mesgarian Z, et al. Identification of Leishmania species isolated from human cutaneous Leishmaniasis in Gonbad-e-Qabus city using a PCR method during 2006-2007. Tehran Univ Med J 2010; 68(4): 250-256 (Persian).

.51 Razmjoua Sh, Hejazy H, Motazedian MH, Baghaei M, Emamy M, Kalantary M. A new focus of zoonotic cutaneous leishmaniasis in

 

 

 


Comments are Closed